BioTNT 十五年real time PCR mRNA 检测倾情服务！ 优质服务品质回报社会！
BioTNT 生物技术服务部自从1999年成立以来，承接了超过5000个qPCR 技术服务项目，积累了广泛的qPCR 定量检测的经验。
一、荧光定量PCR概述
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。
随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。
目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅 2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达1000多篇。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。
实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实 时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的 mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。
BioTNT为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆由BioTNT进行品质保证；实验结束后，可以提供客户完整的实验数据；并可以有一次免费的技术培训。
BioTNT mRNA QPCR 检测使用的仪器
进行检测使用的主要仪器为QPCR， BioTNT 使用life technology新款的ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统进行microRNA的QPCR 检测。
ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统在单一的高性能仪器上融合了您需要的所有实时荧光定量PCR特性，从而帮助您优化研究效率。ViiA™7系统具有简单的工作流 程、直观的软件、触控屏界面以及使误操作降至少的单键实验方案，可提供出众的重复性和小的孔间和仪器间差异。
产率
ViiA™ 7系统适用于中等至高通量实时荧光定量PCR，可提升您的实验室效率。
快速的加热块更换——前开门设计使热循环加热模块的更换变得更容易，无需移动旁边的设备，如机械臂或计算机
简单的触摸屏界面——仪器触摸屏提供了一键式实验方案，可快速简单地完成各种应用Assay的设置
自动化兼容性——ViiA™ 7系统结合了Applied Biosystems® Twister® II 机器人，使您在自动化环境下实现效率大化
整合
可与TaqMan® Array微流体芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容：实时荧光定量PCR分析的金标准，具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。
384 孔通量且无需机器辅助——采用TaqMan® Array微流体芯片，无需移液机器人或复杂的移液装置；只需加入您的样本和预混液，即可在ViiA™ 7系统上运行
与全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系统已经过优化，可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白质、非编码 RNA 和Pri-miRNA Assay)，从而获得清晰简洁的数据
性能
ViiA™ 7系统具有下列特点：
OptiFlex® 系统——增强型荧光检测，可实现准确且灵敏的数据分析
大程度的多重分析能力——6 个可自由组合的激发和发射滤光片通道，可实现多的染料组合和大的多重反应能力
灵活的数据采集——多种升降温方法检测形式为升降温阶段的荧光数据采集提供了更多的灵活性
精确定量——在单色反应中可检测出低至1.5倍的拷贝数差异
ViiA™ 7软件具有：
直观的界面和创新的设计
便捷的自动化操作
更强大的数据分析
与高通量完全兼容
可扩展的软件构架
提供可选的附加性能，可升级至现有软件。
遵循美国联邦法规第21章第11节(21 CFR Part 11)——可选的SAE模块，提供记录安全、审计和电子签名信息，从而实现全方位的数据可追溯性
高分辨率熔解曲线(HRM)——采用内置的MeltDoctor™ 实验方案和校准，您可以缩短优化运行的时间，从而将更多的时间用于分析您的结果。通过方便的软件设置即可根据需要设置基因型种类的数目。
仪器
二、荧光定量化学原理介绍
目前比较主流的有两类，一类是特异性荧光探针法，以taqman 荧光探针为代表；
一类是非特异的荧光染料法，这个以sybgreen 染料为代表。
☆TaqMan荧光探针
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统 可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图所示。
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☆SYBR Green荧光染料
SYBR Green是一种DNA结合染料，能掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。
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染料法的特点：经济。因为可以通用，荧光染料PCR的使用成本比探针的价格要便宜得多。
但由于染料能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，需要结合熔解曲线来判断产物的特异性，并通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。采用sybr green 荧光染料法进行real time PCR 实验，重要的是熔解曲线和扩增曲线结合起来进行判断。
三、BioTNT QPCR mRNA检测服务样品准备
◇ 足量的并且保证纯度的细胞或组织
注意：BioTNT QPCR mRNA 检测的样本取样同Real time PCR microRNA的组织取样与保存：
1、 取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；
2、 讲样本迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；
5、 速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
BioTNT QPCR mRNA 检测的样本取样同Real time PCR microRNA的细胞取样与保存
1、 悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；
2、 加入1ml Trizol 到冻存管中，吹打混匀；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA，因为即使冻存，降解仍然存在。
样本运输：液氮运输
四、BioTNT mRNA 检测技术服务标准流程：
1、 客户提供样本（组织，细胞或者RNA)，请参照取样与保存；
2、 客户提供检测指标；
3、与客户协商内参的选取（人，大鼠，小鼠均有两种内参可以采用）；
4、客户样本验证进行抽提，特异性逆转录，QPCR 检测，验证系统是否好用；
5、 客户的大批量样本进行处理，抽提和实验。
实验对象为组织样品，组织量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，细胞数量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
6、 RNA 特异性逆转录得到内参CDNA， 对样本的质量进行验证；
7、 大批量样本real time PCR实验；使用仪器为：ABI 公司的Vii7；
8、 靶基因表达水平结果分析，数据分析方法为：delta delta CT 法；也可以采用相对定量的标准曲线法；
9、 提供客户实验报告；包括方法，材料，设备，原始数据和计算数据的成套材料；
五、BioTNT real time PCR mRNA检测技术服务收费标准
☆ 实验步骤
样本制备+验证：
客户提供组织或者细胞样本；
组织样本分为容易匀浆的样本和难匀浆的样本；
| 样本处理费用 |
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| 样本类型 |
实验方法与要求 |
服务项目 |
单价 |
| 易匀浆组织或细胞 |
Trizol 法 |
总RNA抽提+逆转录+样本验证 |
80元/样本 |
| 离心柱RNA 抽提试剂盒（Qiagen） |
总RNA抽提+逆转录+样本验证 |
120元/样 |
| 全血样本 |
全血样本，提供淋巴细胞分离细胞 |
总RNA抽提+逆转录+样本验证 |
120元/样 |
| 全血样本，不提供淋巴细胞分离细胞 |
淋巴细胞分离+总RNA抽提+逆转录+样本验证 |
140元/样本 |
| 难匀浆的样本 |
需要手工匀浆，如软骨组织，眼角膜，皮肤等 |
处理附加费+总RNA抽提+逆转录+样本验证 |
120元/样本 |
| RNA样本 |
需提供RNA 检测浓度和纯度； |
RNA 逆转录+CDNA样本验证 |
40元/样 |
| CDNA 样本 |
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样本预验证费用 |
10元/样本 |
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| QPCR检查费 |
实验重复 |
实验费用 |
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| 样本数<5 |
双重复数据（单基因） |
300元 |
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| 样本数<4 |
三重复数据（单基因） |
300元 |
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| 样本数≥5 |
双重复数据(一个标本一个基因) |
65元 |
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| 样本数≥4 |
三重复数据(一个标本一个基因) |
80元 |
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| 引物设计验证 |
QPCR费用大于300元（免费) |
0元 |
☆ 全套技术服务
您只需提供组织或细胞标本，我们为您完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
【您只需提供】
◇ 组织
◇ 或，高浓度的Total RNA
◇ 或，样品的cDNA
◇ 基因序列、来源等背景资料
【我们向您提供】
◇ 实验材料、仪器、方法、步骤
◇ 供发表的引物序列、扩增曲线、熔解曲线
◇ 原始实验数据和计算好的正式实验数据
◇ 免费实验培训、技术支持
| BioTNT Real time PCR技术服务风险说明和客户承诺书 |
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| 尊敬的客户，您好： |
| 非常感谢您采用BioTNT real time PCR 技术服务。使用本服务前，请您详细阅读本说明，希望能够对您的实验有所帮助。 |
| 科学研究存在一定风险，为了保障您的实验可以顺利完成，科研经费能够合理应用，BioTNT在长期的科研服务过程中，积累了大量的实践经验，并建立了较为科学，合理的实验流程体系；以real time PCR 实验为例，BioTNT经过与不同实验单位的科研合作，总结了以下对实验影响较大的因素： |
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Ø 不同的样本特性均不同，BioTNT多年来积累了不同样本的抽提，经验较为丰富，但是样本在采集，保存，运输，抽提等环节都会存在不同的问题或风险，所以在实验前BioTNT针对样本情况会跟您沟通，同时也请望您提供部分不重要的样本以进行预实验的摸索和测定；
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| Ø 内参的选择对实验数据的统计有着重要的作用，BioTNT安排了内参的选择这一步骤来为您降低实验和数据统计风险；为了降低整体的经费使用风险，BioTNT的内参验证，为您的费用使用提供了进一步的依据。 |
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Ø 针对大样本客户，BioTNT希望通过一步一步的技术服务步骤和分阶段的实验服务，达到有效控制和杜绝经费的浪费。
大样本客户：泛指样本数量超过20个样本进行基因检测的客户；
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以下收费和付款方式仅对上海本地客户有效，非上海客户，必须签定技术服务合同，并预付50%，BioTNT 安排样本抽提和预实验；扩大性预实验结束后，BioTNT 核算费用，开具剩余发票并请您付清余款。收到全款后BioTNT 会邮寄数据光盘给您。
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| BioTNT Real time PCR技术服务主要内容为： |
| 1. 实验前端：实验订单确认，目的基因设计、确认、合成，样本取样，样本抽提； |
| BioTNT 会与您进行基因确认，内参选择和内参验证，并发送相应的实验报告； |
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由于您的样本量比较大，在订单确认后，BioTNT 会根据您的样本量，开具样本抽提费用发票；
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| 2. 实验中端：样本的内参筛选，CDNA（样本）内参验证，目的基因验证，预实验，扩大性预实验及相关的验证报告； |
| a) 对于大样本的客户，进行内参筛选非常重要：不同的内参，实验模型或者用药都可能会影响内参的含量，故要选择内参差异性小的作为正式实验的内参。建议采用内参筛选或者双内参的实验模式； |
| b) CDNA内参验证： 内参筛选完成后，BioTNT将对您的CDNA进行一一验证并出具相关的内参验证报告；对于内参验证ct>25的CDNA（样本），BioTNT建议客户不用做正式实验数据； |
| c) 目的基因验证：BioTNT一般设计两对引物，采用同类型的样本验证目的基因，确保所有目的基因为可用的且效率较高，如目的基因不好BioTNT将免费设计新的引物。 |
| d) 预实验验证：随机抽取2-3个CDNA样本单孔验证目的基因，确保目的基因为可用的； |
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e) 扩大性预实验：目的基因验证完好，我们将跟您沟通选择5-10个样本（建议选择不同组的样本）进行双复孔的扩大性实验，并提供给您正规的数据报告，并确认此实验结果是否符合您的预期或其他问题请提前沟通。并协商下一步实验方案。
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| Ø BioTNT 承诺提供的正式数据是按照客户要求的重复方式，并在扩增曲线，融解曲线以及重复性上能达到实验要求的数据。 |
| Ø 如果扩大性预实验不符合预期，建议采用分批实验的方式，请客户选择下一批要进行实验的样本，并结清本段实验费用。 |
| Ø 如果扩大性预实验符合预期，同样为保险起见，仍建议客户采用分批实验的方式，请客户选择下一批要进行实验的样本，并结清本段实验费用。 |
| Ø 如果扩大性实验符合预期，客户对数据要求比较着急，需要一次性完成下面的实验，请客户通过邮件或者书面申明的方式，告知BioTNT，直接进行正式的实验，并承担实验结果可能不符合预期的风险。请客户结清本段实验费用，并预先开具剩余金额60%的发票。 |
| 3. 实验末端：正式实验，实验数据处理，完整数据报告，实验相关流程； |
| 根据上一阶段与客户的协商情况，完成剩余实验，并开具剩余金额的发票。 |
| 4. 全额付款后请申请引物序列； |
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| 备注：请您已经了解本次实验的相关风险，并同意上述条款。 |